17.11.2016 15:18

Первое применение в Российской Федерации прямой генотерапии у лошадей с повреждением сухожилий и связок

Уважаемые коллеги !

С радостью хотим Вам сообщить, что ветеринарная клиника КСК «Новый Век», под руководством профессора, доктора ветеринарных наук Ковач Миломира первый раз в Российской Федерации начала применять прямую генотерапию с фактором роста VEGF и FGF при повреждении сухожилий и связок у лошадей.
На шести лошадях было проведено первое не только в Российской Федерации, но и в Европе, успешное введение генотерапевтического препарата, содержащего последовательности генов сосудистого эндотелиального фактора роста 164 (VEGF-164) и фактор роста фибробластов 2 (FGF2) для восстановления тяжёлого повреждения поддерживающей связки и сухожилия поверхностного сгибателя пальца.
Гены с этим полезным фактором роста при лечении повреждений сухожилий у лошадей - VEGF и FGF был предоставлен нашей клинике, доктором Ярославом Литвином из Казанского государственного медицинского университета Росздрава.


Суть метода – генотерапии:

Генная инженерия служит для получения желаемых качеств генетически изменяемого или модифицированного организма. Первая работа с применением генотерапии  в медицине людей была начата английским учёным Ф. Сенгером и У. Гилбертом, которые по этой причины получил Нобелевскую премию по 1980 г.

Как известно, в генах содержится информация - инструкция для синтеза в организме молекул РНК и белков, в том числе ферментов. Чтобы заставить клетку синтезировать новые, необычные для неё вещества, надо чтобы в ней синтезировались соответствующие наборы ферментов. А для этого необходимо или целенаправленно изменить находящиеся в ней гены, или ввести в неё новые, ранее отсутствовавшие гены.  По этой причини основные этапы решения генно-инженерной терапии следующие:

1.Получение изолированного гена.

Процесс синтеза генов при геноинжинерии в значительной степени автоматизирован. Существуют специальные аппараты, снабжённые ЭВМ, в памяти которых закладывают программы синтеза различных нуклеотидных последовательностей, т.е. гена ответственного за синтез желательного белка. Такой аппарат синтезирует отрезки ДНК длиной до 100—120 азотистых оснований (олигонуклеотиды).  Чтобы встроить ген в вектор, используют ферменты — рестриктазы и лигазы. С помощью рестриктаз ген и вектор можно разрезать на кусочки. С помощью лигаз такие кусочки можно «склеивать», соединять в иной комбинации, конструируя новый ген или заключая его в вектор. За открытие рестриктаз Вернер Арбер, Даниел Натанс были удостоены Нобелевской премии (1988 г.).

2. Введение гена в вектор для переноса в организм

Чаще всего как вектор в генотерапии  используется аденовирусы или плазмиды.В нашем случаю мы использовали плазмиды. Плазмиды — небольшие молекулы ДНК, физически отдельные от геномных хромосом и способные реплицироваться автономно. Как правило, плазмиды встречаются у бактерий и представляют собой двухцепочечные кольцевые молекулы, но изредка плазмиды встречаются также и эукариот. Для проведения восстановления поврежденной соединительной ткани сухожилия и связки была создана Казанским государственным медицинским университетом генетическая конструкция на основе плазмидной ДНК (названная pBUDK-ecVEGF164-ecFGF2). В качестве основы для вектора был использован плазмид pBudCE 4.1 (Invitrogen), в который для одновременной экспрессии были клонированы видоспецифичные и кодон-оптимизированные гены лошадиVEGF-164 (сосудистого эндотелиального фактора роста 164) и FGF2 (основного фактора роста фибробластов) под контролем промоторов EF-1α и CMV соответственно. Создание генетической конструкции проводили стандартными генно инженерными методами ДНК-клонирования, с последующей наработкой и очисткой плазмидной ДНК в препаративном количестве и пригодной для инъекции в организм животного. Полученный стерильный препарат содержал ≥95% суперскрученной формы плазмидной ДНК, по данным анализа с помощью электрофореза в агарозном геле. Концентрация эндотоксина составила ≤0.03 EU/ug. Сухой препарат плазмидной ДНК в дозе 5 мг хранился при температуре -20ºС.

3. Перенос вектора с геном в поврежденный участок организма.

В нашем случае это введение в острое поврежденное сухожилие поверхностного сгибателя пальца и поддерживающей связки у лошади геннотерапевтического препарата в плазмиде, содержащего последовательности генов сосудистого эндотелиального фактора роста 164 (VEGF-164) и фактор роста фибробластов 2 (FGF2).

Почему мы использовали гены белков фактора VEGF и FGF роста при повреждении сухожилия ?

Фактор роста эндотелия сосудов (VEGF; Vascular endothelial growth factor) — сигнальный белок, вырабатываемый клетками для стимулирования васкулогенеза и ангиогенеза (рост новых сосудов в уже существующей сосудистой системе), обеспечение коллатерального кровообращения. Белки VEGF служат частью системы, отвечающей за восстановление подачи кислорода к тканям в ситуации, когда циркуляция крови недостаточна.
Факторы роста фибробластов (FGFs), относятся к семейству факторов роста, участвующих в ангиогенезе, заживлении ран и эмбриональном развитии (миогенное действие), а также в процессах пролиферации и дифференцировки широкого спектра клеток и тканей.

Как мы делали подготовку и введение генетического препарата:

Препарат в пробирке растворили в 5 мл стерильного физиологического раствора 0,9% NaCl до конечной концентрации 1 мг/мл. Растворенный препарат поставили на ночь при +4ºС в холодильник, периодически перемешивая покачиванием и переворачиванием. Перед самим введением в повреждённую ткань, растворенный препарат нагревали до температуры +37ºС. Набрали в шприц 3.5 мл раствора препарата от общего объема и под ультразвуковым контролем и при асептических условиях ввели в место повреждения сухожилия у лошадей. Набранный объем использовали для обкалывания самого места поврежденной и прилегающих здоровых тканей. Для лечения повреждения связки и сухожилия применяли только однократное введение препарата. После введения препарата на конечность поставили плотную повязку и предоставили лошадям строгий покой в течение 2-х дней, а потом назначили шаговую нагрузку в течение 3-х недель.

Эффект лечения оценивали в условиях ветеринарной клиники при помощи регулярного клинического наблюдения, физиологических тестов и ультразвуковой диагностики. Как результат в период от 2-3 месяцев наблюдается полное восстановление функциональной способности поврежденной связки и сухожилия после проведенного геннотерапевтического лечения у 5 лошадей (полный возврат на прежний уровень спортивной нагрузки). У одной лошади произошел рецидив заболевания.


ОБСУЖДЕНИЕ

Повреждение сухожилия сгибателя пальца, в том числе и поддерживающей связки, очень частая ортопедическая проблема спортивных лошадей, которая в значительном количестве случаев приводит не только к временной хромоте, но и к рецидивам заболевания с преждевременным окончанием спортивной карьеры таких лошадей.
В нашей клинике в период за 2016 год было применено у 6 лошадей с различным острым и высокой степени повреждения сухожилия поверхностного сгибателя пальца и поддерживающей связки (средний межкостной мышцы) плазмиды cкДНК геном с фактором роста эндотелия сосудов (VEGF) и фактором роста фибробластов (FGF- 2).
После применения плазмиды cкДНК геном сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) и фактора роста фибробластов (FGF) можно наблюдать «неожиданно» быструю полную регенерацию сухожилия в период с 2 месяцев по 5 лошадей (измеряя эхогенность  и площадь повреждения, процент параллельности коллагеновых волокон), по сравнению с медикаментозным и остальным регенеративным методами лечения (как пример стволовые клетки, плазма обогащена тромбоцитам).
Причина быстрого действия на заживление повреждённой связки и сухожилия лошади при помощи прямой генной терапии с VEGF и FGF2 ещё недостаточно известно. На основе некоторых исследования, факторы роста VEGF и FGF2 — представляют собой полипептиды, которые в месте повреждения выделяют, прежде всего, тромбоциты, фибробласты и эндотелиальные клетки.
Можно предположить и следующий механизм действия: сухожилия и связочная ткань имеют низкую степень кровоснабжения, процент обновления клеток и метаболизм снижены по сравнению с другими тканями при повреждении. По этой причине, применение  плазмидов  cкДНК геном сухожилий и связок через усиление кровоснабжения, и пролиферации фибробласта (тендобласта) приводит к явному быстрому заживлению поврежденного сухожилия.  Механизм их действия сложный и тесно связан с другими факторами воспаления и регенерации. Прежде всего, считается, что они через усиленный  ангиогенез (процесс образования новых кровеносных сосудов) стимулируют транспорт к месту повреждения тендобластов (фибробластов) и мезенхимных стволовых клеток, которые ответственны за продукцию коллагена и других составляющих частей внеклеточных компонентов сухожилий и связок – протеогликановгликозаминогликанов и гликопротеинов.
Генная терапия, как одна от самых передовых технологии в медицине, кроме лечения наследственных заболеваний, открывает постоянно новые возможности для клинического лечения многочисленных ортопедических заболеваний, в этом числе повреждения сухожилия и связки. Поэтому использование технологии рекомбинантной ДНК (прямой генной терапии) имеет большую перспективу при лечении ортопедических заболеваний не только лошадей, но и других видов животных и человека.


ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В ветеринарной клинике КСК «Новый Век» был успешно протестирован геннотерапевтический препарат, содержащий последовательности генов сосудистого эндотелиального фактора роста 164 (VEGF-164) и фактора роста фибробластов 2 (FGF2).Исследования были проведены на шести спортивных лошадях, имеющих различные степени повреждения сухожилий и третьего межкостного мускула . Это инновационный метод в ветеринарной практике лошадей, не только в России, а также и в Европе.

Результаты и опыт этого применения, уже были презентованы в докладе профессора Ковач Миломира 
24 апреля 2016 на главном ветеринарном Конгрессе в России.- XXIV Московский международный ветеринарный конгресс является крупнейшим ветеринарным конгрессом в восточной Европе и собирает более 3000 участников.
Опыт этого применения будет представлен и на международном конгрессе в Барселоне по болезням лошадей. Наше исследование на международном конгрессе будет презентовано под названием:

Generation of Plasmid DNA Expressing Species-Specific Horse VEGF164 and FGF2 Factors for Gene Therapy, and Clinical Application for Direct Gene Therapy for the Treatment of Equine Tendinitis and Desmitis

 

Постскриптум:

Наша ветеринарная клиника КСК «Новый Век» очередной раз подчеркнула, что принадлежит к выдающимся, самым продвинутым с научной точки зрения ветеринарным клиникам Российской Федерации, как от начала её существования с 2007 года, уже сделано не первый раз на русскоязычном пространстве несколько уникальных методов лечения в ветеринарии.  Так например, ветеринарная клиника «Новый Век» первая начинала в Российской Федерации проводить полостные операции на желудочно-кишечном тракте лошадей. Первая начинала проводить лапароскопические операции при абдоминальном крипторхизме лошадей, первая начинала применять криохирургию при удалении абдоминальных и кожных опухолей, первая начинала применять плазму, обогащенной тромбоцитами (Osteokine-PRP), и культуру мезенхимальных стволовых клеток при повреждении сухожилий и связок у лошадей, первая начинала в России проводит операцию по удалению измененного стекловидного тела и рубцовой ткани с поверхности сетчатки (витрэктомия парс плана) при периодическом воспалении глаза у лошадей, первая начинала проводит операцию установка внутрисклерального силиконового протеза у лошади после эвисцерации глазного яблока.

 

 Рис 1. Схема применения генотерапии при повреждении сухожилия

 Рис 1. Схема применения генотерапии при повреждении сухожилия

 

 

Рис 2. Схема введения синтетического гена в плазмид

 Рис 2. Схема введения синтетического гена в плазмид

 

Рис 3. Плазмид с синтетическим геном.

Рис 3. Плазмид с синтетическим геном.

 

Рис 4. Препарат плазмида с синтетическим геном

Рис 4. Препарат плазмида с синтетическим геном

 

Рис 5. Приготовление препарата для введения в сухожилия

Рис 5. Приготовление препарата для введения в сухожилия

 

Рис 6. Введение препарата в поврежденное сухожилие

Рис 6. Введение препарата в поврежденное сухожилие

 

Рис 7. Повреждение сухожилия поверхностного сгибателя пальца до введения преперата

Рис 7. Повреждение сухожилия поверхностного сгибателя пальца до введения преперата

 

Рис 8. Повреждение сухожилия поверхностного сгибателя пальца через два месяца после введения преперата

Рис 8. Повреждение сухожилия поверхностного сгибателя пальца через два месяца после введения преперата